人MBP18.5kD變體抗原表位肽及特異性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人MBP 18.5kD變體抗原表位肽及其特異 性檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，感染性疾病是最常見的病患之一，其最嚴(yán)重的并發(fā)癥可能莫過于腦部 的繼發(fā)性感染，血腦屏障的存在雖然很大程度上避免了腦部受損的可能，但是一旦被病原 體突破將會(huì)有嚴(yán)重的后遺癥，如導(dǎo)致意識(shí)、感覺、運(yùn)動(dòng)等障礙，重者危及生命。除了繼發(fā)性感 染，缺血、缺氧、物理性或化學(xué)性損傷或腦部的原發(fā)性病變都能引起腦部不同程度的損傷。 盡管腦部有著令人驚異的自我調(diào)節(jié)能力，但是與我們機(jī)體的其它器官相比，腦部的自我恢 復(fù)能力卻差得多，因此早期，快速及時(shí)的發(fā)現(xiàn)是否存在腦部原發(fā)性或繼發(fā)性感染或損傷，并 在有效時(shí)間內(nèi)控制疾病的發(fā)展對(duì)病人的愈后及減少死亡率有著重大的臨床意義。
[0003] 雖然普通感染性疾病發(fā)生繼發(fā)性腦部感染的幾率并不大，但后果極其嚴(yán)重，往往 給病人身心和經(jīng)濟(jì)造成巨大痛苦和損失。目前臨床上并沒有針對(duì)普通感染性疾病大規(guī)模的 進(jìn)行腦部感染的排除性檢測(cè)，其主要原因在于，傳統(tǒng)的常見方法(主要是行腰椎穿刺術(shù)獲取 腦脊液進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)或炎癥蛋白檢測(cè)）病人痛苦大，有一定的二次感染危險(xiǎn)；而腦電 圖、腦超聲波、CT掃描等適用范圍主要針對(duì)那些已經(jīng)形成器質(zhì)性腦損傷的患者，價(jià)格高，并 有一定的診斷滯后性，因此建立一種無痛苦或少痛苦并且價(jià)格相對(duì)便宜的檢測(cè)方法來進(jìn)行 快速腦損傷診斷，能大規(guī)模的對(duì)普通感染性疾病患者進(jìn)行腦部繼發(fā)性感染的排除性的檢 查，幫助病人排除嚴(yán)重的腦部繼發(fā)性感染的風(fēng)險(xiǎn)，或者提前早發(fā)現(xiàn)早治療，市場(chǎng)巨大。
[0004] MBP(腦髓鞘堿性蛋白，myelin basic protein)是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及 外周神經(jīng)系統(tǒng)Schwann細(xì)胞中的蛋白，人MBP基因位于第18號(hào)染色體遠(yuǎn)端即18q22-23,共 含有7個(gè)外顯子，通過不同的mRNA剪接，從人腦中可分離出21.5kD、20.2kD、18.5kD和17.2kD 等共4種變體。研究表明，由于MBP蛋白位于髓鞘漿膜面，其與髓鞘膜帶負(fù)電荷的磷脂相互作 用后會(huì)緊密結(jié)合，對(duì)于維持CNS髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定、神經(jīng)傳導(dǎo)絕緣和快速傳導(dǎo)具有重要作 用，并在髓鞘形成和腦分化成熟過程中扮演重要角色。此外，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷時(shí)， 進(jìn)而在血腦屏障受到破壞而導(dǎo)致其通透性改變后，作為髓鞘組分的MBP會(huì)游離進(jìn)入血液中， 使血清中MBP含量明顯增高。因此MBP在血清中的濃度，可以作為一種判斷神經(jīng)損傷嚴(yán)重程 度、損傷范圍及預(yù)后的重要定量指標(biāo)，其變化程度能準(zhǔn)確地反映神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及演 變。
[0005] 研究者們發(fā)現(xiàn)，在MBP的四種變體中，18.5kD變體被稱為"經(jīng)典" MBP，其在人腦中含 量最高，且相對(duì)于其它幾種變體，MBP 18.5kD變體參與了少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和髓鞘的形 成。過程中可與Fyn激酶相互作用。同時(shí)，MBP還與很多其它蛋白結(jié)合，包括骨架蛋白（如肌動(dòng) 蛋白、微管蛋白等）；鈣離子活化的鈣調(diào)素;包含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白等，發(fā)揮其特殊的生物學(xué) 功能，包括參與細(xì)胞骨架重排、參與Fyn介導(dǎo)的信號(hào)通路、維持機(jī)體鈣含量內(nèi)穩(wěn)等。此外，其 構(gòu)象可塑性也對(duì)其發(fā)揮生物學(xué)功能起到了重要作用。但是由于MBP在人體中存在其它三種 變體，且各種變體間的序列同源性非常高，因此使單獨(dú)定量檢測(cè)18.5kD變體變得十分困難。
[0006] 現(xiàn)有的檢測(cè)MBP的方法主要包括放射免疫法和酶聯(lián)免疫法，靈敏度最低可達(dá) 0.25ng/mL。然而由于四種變體的高同源性，使用常規(guī)方法設(shè)計(jì)出的多肽或蛋白免疫原免疫 動(dòng)物，無法產(chǎn)生特異性識(shí)別18.5kD變體而不識(shí)別其它幾種變體的特異性抗體，因此很難做 到對(duì)人體血清、血漿或其它體液樣品中MBP的18.5kD變體進(jìn)行精確定量，這對(duì)于研究MBP 18.5kD變體的功能造成了很大困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中無法特異性檢測(cè)MBP 18.5kD變體。
[0008] 本發(fā)明提供了一種人MBP 18.5kD變體抗原表位肽，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2所示。其中SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列命名為P1，SEQ ID N0:2所示的氨基 酸序列命名為P2。
[0009] SEQ ID NO:IiGKGRGLSLSRFSff；
[0010] SEQ ID N0:2:KRGSGKDSHHPA〇
[0011] 發(fā)明人經(jīng)過對(duì)MBP基因序列的研究，設(shè)計(jì)出上述兩段多肽序列，經(jīng)檢測(cè)分析及數(shù)據(jù) 統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)抗Pl的抗體可檢測(cè)MBP 21.5kD和18.5kD變體，而抗P2的抗體可檢測(cè)MBP 18.5kD 和17.2kD變體。因此Pl和P2結(jié)合可以作為人MBP 18.5kD變體抗原表位肽。
[0012] 本發(fā)明還提供了特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的抗體對(duì)，包括以氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示的抗原表位肽或其偶聯(lián)物免疫動(dòng)物制備而成的抗體AbPl，和以氨基酸序 列如SEQ ID NO: 2所示的抗原表位肽或其偶聯(lián)物免疫動(dòng)物制備而成的抗體AbPS13AbPl和 AbP2可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體，制備方法采用常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)即可。
[0013]本發(fā)明還提供了一種特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其包括以上所述的 抗體AbPl和AbP2。
[0014] 優(yōu)選地，所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，包括包被了 AbPl或AbP2 的固相載體、酶標(biāo)記的AbP2或AbPl，以及酶反應(yīng)的底物;其中固相載體包被的抗體和酶標(biāo)記 的抗體不同。
[0015] 優(yōu)選地，所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，包括經(jīng)AbPl包被的固相 載體，生物素標(biāo)記的AbP2，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素，底物A和底物B;其中，底物A為 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的魯米諾（1^1111；[11015-4111；[110-2,3-(1;[117(11'0-1，4-。111:11&1&2；[116(1;[0116);底物13 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的H 202。該試劑盒中試劑組成的設(shè)計(jì)原理為化學(xué)發(fā)光免疫法。
[0016] 優(yōu)選地，所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，包括經(jīng)AbP 1包被的固相 載體、生物素標(biāo)記的AbP2、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素、3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺TMB 顯色液、濃度為2mol/L的硫酸終止液。該試劑盒中試劑組成的設(shè)計(jì)原理為雙抗體夾心酶聯(lián) 免疫吸附法。
[0017] 優(yōu)選地，所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋液，所述標(biāo)準(zhǔn)品為MBP 18.5kD變體蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %的BSA和質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0.02%的疊氮化鈉的TBS溶液。
[0018] 優(yōu)選地，所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，MBP 18.5kD變體蛋白的 制備方法包括：以SEQ ID N0:3~4所示的核苷酸序列為引物(下劃線部分為酶切位點(diǎn)，酶切 位點(diǎn)前面是保護(hù)堿基），人的MBP 18.5kD變體基因型腦組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 MBP 18.5kD變體的DNA序列，將DNA序列經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切，連接至PET28a載體中得表達(dá) 質(zhì)粒;表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核細(xì)胞，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)18.5kD變體蛋白。
[0019] 上游：SEQ ID NO: 3:5 ' -CGGAATTCATGGCGTCACAGAAGAGACC-3 ' ；
[0020] 下游：SEQ ID NO: 4:5 ' -CCGCTCGAGTCAGCGTCTAGCCATGGG-3 '。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明分別選取了MBP 18.5kD變體的兩條不同多肽，并由此提供了含有這兩 種抗原肽多抗的ELISA試劑盒，可特異性檢測(cè)MBP 18.5kD變體，而與其它三種變體無顯著交 叉反應(yīng)性，特異性強(qiáng)。
[0023] (2)本發(fā)明可采用雙抗體夾心酶聯(lián)和化學(xué)發(fā)光兩種檢測(cè)手段，此兩種方法各有優(yōu) 點(diǎn)，可根據(jù)用戶的不同需求自由選擇。雙夾心酶聯(lián)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于:可使用普通酶標(biāo)儀進(jìn)行 檢測(cè)，不需要其它特殊儀器?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于:檢測(cè)范圍更廣、靈敏度更高。
[0024] (3)本發(fā)明所提供的MBP 18.5kD變體的檢測(cè)方法操作步驟簡便可控，利于臨床檢 測(cè)，可進(jìn)行高通量、低成本的檢測(cè)。
[0025] (4)本發(fā)明的ELISA試劑盒能夠在腦部損傷早期診斷中，起到輔助診斷的作用，具 有明顯的實(shí)用性。
【附圖說明】
[0026] 圖1是MBP四種變體(21.5kD、20.2kD、18.5kD和17.2kD)的外顯子示意圖。
[0027]圖2是原核系統(tǒng)表達(dá)的MBP四種變體重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，泳道M為分子量 標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為21.5kD變體，泳道2為20.2kD變體，泳道3為18.5kD變體，泳道4為17.2kD變體。
[0028] 圖3是多克隆抗體AbPl '的Western Blot驗(yàn)證結(jié)果。
[0029] 圖4是多克隆抗體AbP2'的Western Blot驗(yàn)證結(jié)果。
[0030]圖5是利用多克隆抗體AbPl'和AbP2'制備的雙抗體夾心酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒對(duì)MBP四 種變體重組蛋白（21.5kD、20.2kD、18.5kD和17.2kD)的檢測(cè)結(jié)果。
[0031 ]圖6是利用多克隆抗體AbPl'和AbP2'制備的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)MBP四種變體 重組蛋白（21.5kD、20.2kD、18.5kD和17.2kD)的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地 理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0033] 在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或 替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0034]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手 段。
[0035]如附圖1所示，通過對(duì)人MBP四種變體的序列特點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，分別合成了2種不同多 肽，命名為Pl和P2，P1氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示，P2氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示;其中Pl為變體21.5kD和變體18.5kD所共有，P2為變體18.5kD和變體17.2kD所共 有，變體20.2kD序列中不含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N