張濾紙，然后夾于半干轉(zhuǎn)膜裝置中，膜朝正極，膠向負(fù)極，根據(jù)膜面積大小，以1.25mA/ cm2的恒流，轉(zhuǎn)膜90min;
[0109] 6)檢測(cè)硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)：將膜浸在麗春紅染色液中染色，約3min可見(jiàn)紅 色蛋白質(zhì)色帶出現(xiàn)，然后將膜浸在蒸餾水中脫色，輕輕搖動(dòng)數(shù)分鐘，然后更換脫色液數(shù)次， 直至背景色很淡。
[0110] C ·免疫學(xué)檢測(cè)：
[0111] 1)封閉:轉(zhuǎn)膜后，將硝酸纖維素膜置PBST溶液中，緩搖lOmin，然后膜于封閉液中37 °C搖床緩慢平搖2h;
[0112] 2)結(jié)合一抗:封閉后將硝酸纖維素膜移入一抗(AbPl '和AbP2'分別對(duì)應(yīng)單獨(dú)的硝 酸纖維素膜），4°C過(guò)夜或室溫平搖3h;回收一抗，硝酸纖維素膜浸入PBST溶液20mL中，急搖 IOmin，連續(xù)3次，清洗膜上殘余一抗；
[0113] 3)結(jié)合二抗：將硝酸纖維素膜移入馬抗兔二抗(購(gòu)自Cloud-Clone . Corp)反應(yīng)液 中，室溫平搖2h后，硝酸纖維素膜浸入PBST溶液30mL中，急搖15min，連續(xù)3次，清洗膜上殘余 二抗；
[0114] 4)免疫復(fù)合物的檢測(cè):GE ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影拍照。 [0115] 經(jīng)蛋白印跡(western blot)驗(yàn)證，結(jié)果顯示抗Pl的多克隆抗體AbPl '可特異性識(shí) 別MBP21.5kD和18.5kD變體，如圖3所示;抗P2的多克隆抗體AbP2 '可特異性識(shí)別MBP 18.5kD 和17.2kD變體，如圖4所示。
[0116] 實(shí)施例4MBP 18.5kD變體ELSIA試劑盒的研制與組裝
[0117] MBP 18.5kD變體雙抗體夾心酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒組分包括：
[0118] 1)標(biāo)準(zhǔn)品：含重組MBP 18.5kD變體蛋白凍干粉；
[0119] 2)包被有抗Pl的多克隆抗體AbPl'的96孔聚苯乙烯試劑板(PS);
[0120] 3)生物素化的抗P2的多克隆抗體AbP2' ；
[0121 ] 4)辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素；
[0122] 5)TMB顯色液:3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺；
[0123] 6)終止液:2M硫酸；
[0124] 7)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液:含2 %BSA、0.02 %疊氮化鈉的TBS溶液，均為質(zhì)量百分比濃度。
[0125] MBP 18.5kD變體雙抗體夾心酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒制備過(guò)程如下:使用96孔聚苯乙 烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2h，使PS板活化。在試劑板微孔條上 預(yù)先包被一定濃度的抗Pl的多克隆抗體AbPl'，4°C過(guò)夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理 后制成包被好的酶標(biāo)板(固相載體）。檢測(cè)時(shí)，向微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和血清標(biāo)本，其中的 MBP 18.5kD變體與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，洗板之后加入生物素化的抗P2的多克隆 抗體AbP2 '，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素，再通 過(guò)親和素化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)放大信號(hào)，以3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別 作為底物及終止液，完成MBP 18.5kD變體的酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒的制備。
[0126] MBP 18.5kD變體化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒組分包括：
[0127] 1)標(biāo)準(zhǔn)品：含重組MBP 18.5kD變體蛋白凍干粉；
[0128] 2)包被有抗Pl的多克隆抗體AbPl'的96孔聚苯乙烯試劑板(PS);
[0129] 3)生物素化的抗P2的多克隆抗體AbP2' ；
[0130] 4)辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素；
[0131] 5)底物A:質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2 %的魯米諾；
[0132] 6)底物B:質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的H2O2;
[0133] 7)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液:含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 %BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02 %疊氮化鈉的TBS溶液。
[0134] MBP 18.5kD變體化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒制備過(guò)程如下：使用96孔聚苯乙烯試劑板 (PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2h，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被 一定濃度的抗Pl的多克隆抗體AbPl'，4°C過(guò)夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包 被好的酶標(biāo)板（固相載體）。檢測(cè)時(shí)，向微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和血清標(biāo)本，其中的MBP 18.5kD變體與包被于固相載體上的抗體結(jié)合，洗板之后加入生物素化的抗P2的多克隆抗體 AbP2 '，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素，再次徹底 洗滌后加入底物。加入底物后會(huì)產(chǎn)生輝光型光信號(hào)。發(fā)射光強(qiáng)度和樣品中的IL6呈正相關(guān)。 用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定相對(duì)光單位(RLU)，計(jì)算樣品濃度。
[0135] 實(shí)施例5MBP 18.5kD變體的ELISA檢測(cè)試劑盒交叉反應(yīng)性檢測(cè)
[0136] 將以上總蛋白濃度相同的四種MBP重組蛋白裂解液為樣品，使用本發(fā)明MBP 18.5kD變體的雙抗體夾心酶聯(lián)吸附測(cè)定試劑盒和MBP 18.5kD變體化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒檢 測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖5和圖6所示，其與MBP 18.5kD變體的ELI SA檢測(cè)結(jié)果顯示呈陽(yáng)性，而與其它三 種變體結(jié)果為陰性。證明其對(duì)MBP 18.5kD變體的檢測(cè)是特異性的，且與其它三種變體無(wú)交 叉反應(yīng)性。
[0137] 實(shí)施例6MBP 18.5kD變體的ELISA檢測(cè)試劑盒的靈敏度、重復(fù)性、回收率及線(xiàn)性測(cè) 定
[0138] a.靈敏度檢測(cè)
[0139] 實(shí)施例4的兩種ELISA試劑盒檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí)最低檢測(cè)限為0.055ng/mL;
[0140] b.重復(fù)性檢測(cè)
[0141 ] 精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV表示。CV( % ) = SD/meanX 100
[0142] 批內(nèi)差:取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，每份樣本連續(xù)測(cè) 定20次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。
[0143] 批間差:選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每 個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定8次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。
[0144] 檢測(cè)結(jié)果為批內(nèi)差:(^〈10%;批間差:(^〈12%。
[0145] c.回收率檢測(cè)
[0146] 用同一血清或血漿樣本分別添加不同量的定值標(biāo)準(zhǔn)品，作回收試驗(yàn)(n = 5)。檢測(cè) 其平均回收率(表1)。
[0147] 表1.MBP 18.5kD變體檢測(cè)試劑盒回收率檢測(cè)
[0149] d.線(xiàn)性測(cè)定
[0150] 在定值血清樣本內(nèi)加入適量的MBP，并倍比稀釋成1:2,1:4,1:8,1:16的待測(cè)樣本， 線(xiàn)性范圍即為稀釋后樣本中MBP含量的測(cè)定值與理論值的比率(表2)。
[0151] 表2.MBP 18.5kD變體檢測(cè)試劑盒線(xiàn)性測(cè)定

[0153] 經(jīng)過(guò)對(duì)所述試劑盒一系列的質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)，包括靈敏度、重復(fù)性、特異性、回收率 及線(xiàn)性測(cè)定，表明該檢測(cè)體系成熟，本試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)均符合ELISA行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，可特異性檢 測(cè) MBP 18.5kD 變體。
[0154] 以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人MBP18.5kD變體抗原表位肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDN0:l和SEQID NO: 2所示。2. 特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的抗體對(duì)，其特征在于，包括以氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的抗原表位肽或其偶聯(lián)物免疫動(dòng)物制備而成的抗體AbPl，和以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的抗原表位肽或其偶聯(lián)物免疫動(dòng)物制備而成的抗體AbP2。3. -種特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述的抗 體AbPl和AbP2。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于，包括包 被了 AbPl或AbP2的固相載體、酶標(biāo)記的AbP2或AbPl、以及酶反應(yīng)的底物;其中固相載體包被 的抗體和酶標(biāo)記的抗體不同。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于，包括經(jīng) AbPl包被的固相載體，生物素標(biāo)記的AbP2，辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素，底物A和底物 B;其中，底物A為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的魯米諾;底物B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %的H2〇2。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于，包括經(jīng) AbPl包被的固相載體，生物素標(biāo)記的AbP2，辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的親和素，3，3 '，5，5 ' -四甲基聯(lián)苯胺TMB顯色液，和濃度為2mol/L的硫酸終止液。7. 根據(jù)權(quán)利要求4、5或6所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于， 還包括標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，所述標(biāo)準(zhǔn)品為MBP 18.5kD變體蛋白，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為含質(zhì) 量分?jǐn)?shù)2%的BSA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的疊氮化鈉的TBS溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的特異性檢測(cè)人MBP 18.5kD變體的試劑盒，其特征在于，MBP 18.5kD變體蛋白的制備方法包括：以SEQ ID NO: 3~4所示的核苷酸序列為引物，人的MBP 18.5kD變體基因型腦組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得MBP 18.5kD變體的DNA序列，將 DNA序列經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切，連接至PET28a載體中得表達(dá)質(zhì)粒;表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核細(xì) 胞，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)18.5kD變體蛋白。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人MBP？18.5kD變體抗原表位肽及特異性檢測(cè)試劑盒，該抗原表位肽氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示，含有該兩種序列的免疫原分別制備的抗體對(duì)結(jié)合能夠特異性檢測(cè)MBP？18.5kD變體，制備成的雙抗體夾心酶聯(lián)試劑盒和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)、適用性廣，可進(jìn)行高通量、低成本的酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)，能夠在腦部損傷早期診斷中起到輔助診斷的作用，具有明顯的實(shí)用性。
【IPC分類(lèi)】G01N33/543, G01N33/68, C07K16/18, C07K14/47
【公開(kāi)號(hào)】CN105541992
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610003128
【發(fā)明人】樂(lè)音譜, 李華淵, 何峰容, 孫穎, 姚雯
【申請(qǐng)人】武漢云克隆診斷試劑研究所有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月4日