本發(fā)明屬于免疫檢測，具體涉及一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、阿爾茲海默癥(alzheimer's?disease，ad)是一種起病隱匿、呈緩慢漸進(jìn)性加重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常見于65歲以上老年人，發(fā)病率隨年齡增長而顯著增加。ad特征性病理改變目前被廣泛接受的致病假說有：aβ聚集假說、tau蛋白異常假說、膽堿能假說、神經(jīng)炎癥假說等，其中tau蛋白的磷酸化修飾在該疾病進(jìn)程中至關(guān)重要，tau和app可以在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾，根據(jù)不同的磷酸化位點(diǎn)主要分為t-tau、ptau-181、ptau-217、ptau-231。這些生物標(biāo)志物也可以更快、更少地在血漿中進(jìn)行測量，并可為阿爾茨海默癥的早期診斷提供形成的重要依據(jù)。

2、目前ad的診斷方法主要是聯(lián)合診斷，包括：神經(jīng)心理學(xué)評估，認(rèn)知損傷測試；腦部老年斑塊和tau蛋白pet掃描；腦部核磁共振(mri)和腦脊液(csf)標(biāo)志物，aβ沉積，磷酸化tau蛋白檢測等。但是，由于ad早期癥狀不明顯，當(dāng)對病癥做出明確診斷時(shí)，患者多到達(dá)病程晚期，多數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)死亡，如果能在病人發(fā)病早期進(jìn)行快速診斷或使?jié)撛诓∪颂崆鞍l(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，針對性地進(jìn)行治療或預(yù)防，能有助于患者病程滯留在輕微智力損傷階段(mildcognitive?impairment，mci)而減緩惡化，從而保證病人生活質(zhì)量和減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，如何提供一種ptau-181的檢測試劑和檢測方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)存的阿爾茨海默癥檢測試劑盒操作復(fù)雜、耗費(fèi)昂貴、檢測時(shí)間長、靈敏度低、精密度差、缺少對阿爾茨海默癥的準(zhǔn)確預(yù)測能力等問題，提出一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法及其檢測方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，所述試劑盒包括磁微粒試劑、ae標(biāo)記的ptau-181抗體、ptau-181校準(zhǔn)品，所述磁微粒試劑為包被有ptau-181抗體的磁性微球混懸液；所述ae標(biāo)記的ptau-181抗體通過吖啶酯對ptau-181抗體進(jìn)行標(biāo)記得到。

4、進(jìn)一步的，所述磁微粒試劑中的磁微粒的粒徑為1-3μm，所述磁微粒表面包裹有羧基活性基團(tuán)的磁性微球；

5、所述ptau-181抗體的磁性微球混懸液制備時(shí)按照每50mg磁性微球加入0.5-2.5mg的ptau-181抗體進(jìn)行包被，所述磁微粒試劑中ptau-181抗體與羧基磁珠的質(zhì)量比為1:?20-100，連接反應(yīng)的溫度為室溫，連接反應(yīng)的時(shí)間為16～20h。

6、進(jìn)一步的，所述ae標(biāo)記的ptau-181抗體中ptau-181抗體與吖啶酯的質(zhì)量比為1:1。

7、一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

8、步驟1.?制備磁微粒試劑；

9、步驟1.1.?將羧基磁珠溶液在磁微粒緩沖液的作用下進(jìn)行分散處理，得到分散的羧基磁珠溶液；

10、步驟1.2.?將分散的羧基磁珠溶液和ptau-181抗體進(jìn)行連接反應(yīng)，得到連接產(chǎn)物；

11、步驟1.3.?將連接產(chǎn)物置于磁場中，用磁微粒緩沖液沖洗，制得連接有ptau-181抗體的磁微粒溶液；

12、步驟2.?制備ae標(biāo)記的ptau-181抗體；

13、步驟2.1.?用0.15m的碳酸氫鈉緩沖液將ae配成濃度為5mg/ml的ae溶液；

14、步驟2.2.?將小鼠單克隆抗ptau-181抗體和ae溶液按照質(zhì)量比為1:1混合，進(jìn)行鏈接反應(yīng)，得到ptau-181抗體與ae的鏈接產(chǎn)物；

15、步驟2.3.?將ptau-181抗體與ae的鏈接產(chǎn)物用ph為8～9的碳酸鹽緩沖液分離純化，得到ae標(biāo)記的ptau-181抗體；

16、步驟3.?制備ptau-181校準(zhǔn)品：所述ptau-181校準(zhǔn)品為含有ptau-181抗原、質(zhì)量百分含量為0.5％的bsa、質(zhì)量百分含量為0.05％的prolin300的tris緩沖液；所述ptau-181抗原的濃度分別為20pg/ml和200pg/ml。

17、進(jìn)一步的，步驟1.1中將羧基磁珠濃縮液置于磁場內(nèi)1～3min，待羧基磁珠全部沉降后除去上層清液，然后加入到磁微粒緩沖液振蕩后，置于磁場中1～3min后，除去上層清液；振蕩時(shí)間設(shè)置為20～30min；羧基磁珠和磁微粒緩沖液的體積比為1:2～5，分散處理次數(shù)為3次。

18、進(jìn)一步的，步驟1.2的互通實(shí)現(xiàn)方法包括如下步驟：

19、步驟1.2.1.?按照質(zhì)量比為100:5～100：1稱量分散的羧基磁珠溶液和ptau-181抗體的，分散的羧基磁珠溶液的濃度為10～50mg/ml，設(shè)置連接反應(yīng)的溫度為室溫，連接反應(yīng)的時(shí)間為16～20h；

20、s1.2.2.?連接反應(yīng)完成后添加封閉液進(jìn)行封閉，封閉液的配方為：pbs、3wt%的bsa、1wt%tween-20、1wt%的麥芽糖、5wt%的山梨醇、2wt%的蔗糖、3wt%的甘油、0.1～0.8wt的%peg600的混合溶液。

21、進(jìn)一步的，步驟1.3中所述連接產(chǎn)物置于磁場的時(shí)間為5～10min，然后用磁微粒緩沖液沖洗，制得連接有ptau-181抗體的磁微粒溶液。

22、一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：

23、s1.?準(zhǔn)備磁微粒試劑、ae標(biāo)記的ptau-181抗體；

24、s2.?將血清樣本與步驟s1準(zhǔn)備的ae標(biāo)記的ptau-181抗體加入到磁微粒試劑中進(jìn)行孵育；

25、s3.?孵育完成，待磁微粒試劑沉降后，除去上清液，清洗，然后加入底物溶液振蕩混勻，檢測相對發(fā)光強(qiáng)度。

26、進(jìn)一步的，步驟s2中的血清樣本、ae標(biāo)記的ptau-181抗體和磁微粒試劑的體積比為2:2:1。

27、進(jìn)一步的，步驟s3中檢測相對發(fā)光強(qiáng)度后，經(jīng)高、低值兩點(diǎn)校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)校準(zhǔn)，擬合生成新的工作曲線，用于樣本測定；將ptau-181質(zhì)控品作為樣本，利用工作曲線進(jìn)行濃度擬合，得到相應(yīng)質(zhì)控品濃度，觀察擬合質(zhì)控品濃度為標(biāo)準(zhǔn)濃度值的±30％。

28、本發(fā)明的有益效果：

29、本發(fā)明所述的一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，所述ptau-181試劑盒使用磁珠為固相，使免疫反應(yīng)更接近液相，反應(yīng)更充分和迅速，而且使結(jié)合的免疫復(fù)合物更加容易分離，降低了非特異性吸附。本發(fā)明使用的ae標(biāo)記抗體試劑為單克隆抗體混合物，使免疫反應(yīng)的親和力更高，而且單抗的生產(chǎn)批間差異相對小，更容易保證產(chǎn)品的批間穩(wěn)定。

30、一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，為快速、準(zhǔn)確的ptau-181檢測提供了可能，本發(fā)明對樣品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品，檢驗(yàn)方法方便易行，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中的空白。

31、一種阿爾茲海默癥ptau181化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，具有更高的檢測靈敏度、特異性、精確度和準(zhǔn)確性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。試劑盒中的磁微粒試劑、ae標(biāo)記抗體、校準(zhǔn)品是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。