一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙肝病毒抗原-抗體的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于丙型肝炎檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種丙型肝炎病毒抗原-抗體聯(lián)合 檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV)感染而引起的一種全球 性傳染病。據(jù)估計(jì)目前全世界有1. 7億丙肝病毒感染者，我國(guó)的丙肝感染率大約為30%，目 前至少有4000~6000萬(wàn)丙肝患者。其中有80~85%的感染者將發(fā)展為慢性丙型肝炎，其中又 有20%可發(fā)展為肝纖維化，最終有4~5%的肝纖維化患者發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌，危害十分嚴(yán)重。
[0003] 目前，尚無(wú)針對(duì)丙型肝炎病毒的特效治療藥物，丙型肝炎疫苗的研制也因 HCV快 速變異而困難重重，短期內(nèi)難有突破進(jìn)展。因此，HCV的早期診斷對(duì)于篩查HCV傳染源、指 導(dǎo)臨床治療和預(yù)后判斷有重大意義。
[0004] 現(xiàn)有HCV在臨床上的檢測(cè)方式主要有PCR檢測(cè)、丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)和丙型肝 炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒，三種檢測(cè)方法中，PCR檢測(cè)方法靈敏度高且結(jié)果準(zhǔn)確，但是方 法操作繁瑣，需要的人員技術(shù)能力強(qiáng)，不容易在各個(gè)醫(yī)院進(jìn)行推廣；丙型肝炎病毒抗體檢測(cè) 試劑是臨床上最常見(jiàn)的一種丙肝檢測(cè)方法，但是該檢測(cè)存在一個(gè)"窗口期"，即在丙肝的感 染初期，病人體內(nèi)還沒(méi)有出現(xiàn)免疫性抗體，無(wú)法在早期就獲得檢測(cè)結(jié)果，造成漏診的狀況； 丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑在最近幾年開(kāi)始逐漸被醫(yī)院所接受，市場(chǎng)占有量也不斷增 大，但是針對(duì)于丙肝病人的后期跟蹤檢測(cè)，沒(méi)有很好的跟蹤效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)于各種檢測(cè)方法存在的問(wèn)題，丙型肝炎病毒抗體-抗原聯(lián)合檢測(cè)的試劑就出 現(xiàn)了，本發(fā)明提供一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體-抗原試劑，該試劑利用化 學(xué)發(fā)光法的原理，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)定性檢測(cè)抗原和抗體，能夠確定檢測(cè)樣本中是 否具有丙型肝炎病毒的感染，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的： 一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體-抗原試劑，其組分如下： 組分I (Rl)磁微粒試劑： 磁微粒與羊抗FITC抗體連接物 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分2 (R2) FITC標(biāo)記試劑： FITC標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% FITC標(biāo)記的NS3蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS4蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分3 (R3) AP標(biāo)記試劑： AP標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% AP標(biāo)記的NS3蛋白 1% AP標(biāo)記的NS4蛋白 1% AP標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分4 (R4)樣本稀釋液： 磷酸氫二鈉 I. 974g/L 磷酸二氫鉀 0· 2245g/L BSA 0.5g/L PC-300 0. 1% 組分5 (R5)發(fā)光底物： 二氧雜環(huán)乙烷（AMPPD) 5mmol/L 組分6 (R6)清洗濃縮液： 磷酸氫二鈉 39. 48g/L 磷酸二氫鉀 4. 49g/L 氯化鈉 18g/L 吐溫-20 0. 5% 所有組分都用去離子水進(jìn)行溶解，配制成溶液狀態(tài)。
[0007] 陽(yáng)性對(duì)照： 丙型肝炎病毒核心抗原 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS3) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS4) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS5) 1% 用小牛血清溶解。
[0008] 陰性對(duì)照： BSA 4% 用小牛血清溶解。
[0009] 本發(fā)明一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙肝病毒抗原-抗體的試劑盒的檢測(cè)流程如下： (1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備平底試管，放置在磁分離架上并做好編號(hào)；將R6 (清洗濃縮液） 用20倍去離子水進(jìn)行稀釋?zhuān)瑐溆茫?(2) 在試管中加入15 μ 1陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照或樣本，并加入15 μ I R4 (樣本稀釋液）； (3) 用連續(xù)移液器在試管中加入30 μ I R2 (FITC標(biāo)記試劑）； (4) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕震蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (5) 用連續(xù)移液器在試管中加入30μ1 Rl (磁微粒試劑)，加樣時(shí)要保證磁微粒試劑充 分混勾； (6) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (7) 將磁分離架安放在磁分離器上，確保每支試管底接觸磁分離器，靜置2分鐘，然后 弧線傾倒上清液，把倒置的試管連同磁分離器倒扣在吸水紙上拍干； (8) 用連續(xù)移液器在試管中加入300 μ 1清洗液，將磁分離架從磁分離器上取下，置于 振蕩器上1500~2000rpm震蕩20秒，至徹底混勻，重復(fù)第（7)操作1次； (9) 重復(fù)第（8)操作2次； (10) 用連續(xù)移液器在試管中加入30 μ I R3 (AP標(biāo)記試劑）； (11) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37±1°C溫育5分 鐘； (12) 將磁分離架從磁分離器上取下，每管加入300 μ 1清洗液，置于振蕩器上輕輕震蕩 至徹底混勻，重復(fù)第（7)步操作1次； (13) 重復(fù)第（8)步操作2次； (14) 把試管架從磁分離器上取下，每個(gè)試管加入200 μ 1發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè) 發(fā)光強(qiáng)度。
[0010] 臨界值確定：陰性對(duì)照平均RLU值X 2. 1(若陰性對(duì)照平均RLU值彡100時(shí)，按100 計(jì)算；RLU>100時(shí)，按實(shí)際測(cè)定陰性對(duì)照平均RLU值X 2. 1計(jì)算)。測(cè)試標(biāo)本的RLU值小于 臨界值則為HCV陰性。測(cè)試標(biāo)本中的RLU值等于或大于臨界值則為HCV陽(yáng)性。
[0011] 本發(fā)明試劑盒的反應(yīng)原理圖，如圖1所示，通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)方案，可以獲得一種 同時(shí)檢測(cè)丙型肝炎病毒的抗原-抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，該試劑盒通過(guò)通過(guò)包被抗FITC的磁 微粒與FITC包被的試劑結(jié)合，在與被檢測(cè)物進(jìn)行免疫反應(yīng)，在AP標(biāo)記的物質(zhì)免疫反應(yīng)后， 構(gòu)成免疫反應(yīng)鏈(如圖1)，AP催化底物發(fā)光的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免顯色，增強(qiáng)了反應(yīng)的靈 敏度，同時(shí)利用FITC同時(shí)標(biāo)記抗原和抗體的方式，可以同時(shí)對(duì)丙型肝炎病毒抗體和核心抗 原進(jìn)行檢測(cè)。
[0012] 本發(fā)明一種丙型肝炎病毒抗原-抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的創(chuàng)新之處在于： (1) 利用包被了抗FITC的磁微粒以及FITC標(biāo)記抗丙型肝炎病毒核心抗原的抗體和丙 型肝炎病毒其他亞型重組蛋白的方式，將各種丙肝蛋白包被到磁微粒上，能保證樣本中的 丙肝核心抗原及多種亞型的抗體都可以通過(guò)免疫反應(yīng)吸附到磁微粒表面，避免了漏檢； (2) 試劑盒中的AP標(biāo)記物，是對(duì)包被抗體和抗原配對(duì)的對(duì)應(yīng)抗體和抗原進(jìn)行AP酶標(biāo) 記，能夠與包被抗體和抗原配對(duì)應(yīng)用，保證了試劑盒檢測(cè)的特異性，準(zhǔn)確檢測(cè)丙肝病毒； (3) 本發(fā)明的試劑盒，選用AP催化底物發(fā)光的原理，有效地保證了試劑盒的靈敏度，即 使在微量狀態(tài)下也可以檢測(cè)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)的效果。
[0013]
【附圖說(shuō)明】 圖1本發(fā)明試劑盒的原理圖。 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014] 實(shí)施例1 檢測(cè)試劑的組分及濃度為 組分I (Rl)磁微粒試劑： 磁微粒與羊抗FITC抗體連接物 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分2 (R2) FITC標(biāo)記試劑： FITC標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% FITC標(biāo)記的NS3蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS4蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分3 (R3) AP標(biāo)記試劑： AP標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% AP標(biāo)記的NS3蛋白 1% AP標(biāo)記的NS4蛋白 1% AP標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分4 (R4)樣本稀釋液： 磷酸氫二鈉 I. 974g/L 磷酸二氫鉀 0· 2245g/L BSA 0.5g/L PC-300 0. 1% 組分5 (R5)發(fā)光底物： 二氧雜環(huán)乙烷（AMPPD) 5mmol/L 組分6 (R6)清洗濃縮液： 磷酸氫二鈉 39. 48g/L 磷酸二氫鉀 4. 49g/L 氯化鈉 18g/L 吐溫-20 0. 5% 所有組分都用去離子水進(jìn)行溶解，配制成溶液狀態(tài)。
[0015] 陽(yáng)性對(duì)照： 丙型肝炎病毒核心抗原 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS3) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS4) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS5) 1% 用小牛血清溶解。
[0016] 陰性對(duì)照： BSA 4% 用小牛血清溶解。
[0017] 檢測(cè)流程： (1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備平底試管，放置在磁分離架上并做好編號(hào)；將R6 (清洗濃縮液） 用20倍去離子水進(jìn)行稀