釋，備用； (2) 在試管中加入15 μ 1陽性對(duì)照、陰性對(duì)照或樣本，并加入15 μ I R4 (樣本稀釋液）； (3) 用連續(xù)移液器在試管中加入30 μ I R2 (FITC標(biāo)記試劑）； (4) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕震蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (5) 用連續(xù)移液器在試管中加入30μ1 Rl (磁微粒試劑)，加樣時(shí)要保證磁微粒試劑充 分混勾； (6) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (7) 將磁分離架安放在磁分離器上，確保每支試管底接觸磁分離器，靜置2分鐘，然后 弧線傾倒上清液，把倒置的試管連同磁分離器倒扣在吸水紙上拍干； (8) 用連續(xù)移液器在試管中加入300 μ 1清洗液，將磁分離架從磁分離器上取下，置于 振蕩器上1500~2000rpm震蕩20秒，至徹底混勾，重復(fù)第（7)操作1次； (9) 重復(fù)第（8)操作2次； (10) 用連續(xù)移液器在試管中加入30 μ I R3 (AP標(biāo)記試劑）； (11) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37±1°C溫育5 分鐘； (12) 將磁分離架從磁分離器上取下，每管加入300 μ 1清洗液，置于振蕩器上輕輕震蕩 至徹底混勻，重復(fù)第（7)步操作1次； (13) 重復(fù)第（8)步操作2次 (14) 把試管架從磁分離器上取下，每個(gè)試管加入200 μ 1發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè) 發(fā)光強(qiáng)度。
[0018] 實(shí)施例2 常規(guī)丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法）選自美國(guó)ortho公司，檢測(cè)操作 步驟如下： (1) 平衡：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒及樣品，15-30?放置30分鐘； (2) 配液：所有試劑使用前搖勻，注意瓶?jī)?nèi)不得殘留結(jié)晶，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離 子水20倍稀釋； (3) 加樣：每次檢測(cè)均需設(shè)置空白、陰性、陽性對(duì)照各2孔?？瞻卓准尤?00 μ 1樣品稀 釋液，其他各孔先加入100 μ 1樣品稀釋液，然后陰性對(duì)照孔每孔加入100 μ 1陰性對(duì)照，陽 性對(duì)照孔每孔加入100 μ 1陽性對(duì)照，其余各孔加入100 μ 1待測(cè)樣品； (4) 溫育：混勻后貼上封板膜，置37°C震蕩溫育90分鐘； (5) 洗板：甩去孔內(nèi)混合物，洗板機(jī)洗液洗板6次(底部沖洗)，最后在吸水紙上拍干； (6) 加酶：每孔分別加入酶結(jié)合物20〇μ1，混勻后貼上封板膜，置37°C溫育30分鐘； (7) 洗板：同（5); (8) 顯色：每孔加入顯色劑A、B液各100 μ 1，混勻后置37 °C避光顯色10分鐘； (9) 測(cè)定：每孔加50 4 1終止液，混勻。反應(yīng)終止10分鐘內(nèi)以酶標(biāo)儀45011111或450/63011111 波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值(用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)需用空白對(duì)照調(diào)零)。
[0019] 實(shí)施例3 對(duì)化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙肝病毒抗原-抗體的試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度分析，利用美國(guó) ortho公司的試劑盒作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于40例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)方 法如實(shí)施例1、實(shí)施例2,如果檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)差異，送第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)利用PCR檢測(cè)方法進(jìn)行 驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如表1所示： 表1準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果
經(jīng)過對(duì)比檢測(cè)，其中8號(hào)和24號(hào)樣本檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常，經(jīng)過第三方檢測(cè)驗(yàn)證，實(shí)施例 1 (本發(fā)明)檢測(cè)的結(jié)果更加準(zhǔn)確，出現(xiàn)異常的兩例樣本主要是出現(xiàn)了自身免疫抗體，而丙型 肝炎病毒核心抗原的濃度比較低，造成漏檢。根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果，說明本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié) 果更準(zhǔn)確，防止了漏檢的出現(xiàn)。
[0020] 實(shí)施例4 通過對(duì)陽性樣本稀釋的方法，驗(yàn)證試劑盒的靈敏性?！揪唧w實(shí)施方式】如下： 將一丙型肝炎病毒陽性樣本利用正常陰性樣本進(jìn)行梯度稀釋，利用實(shí)施例1、實(shí)施例2 分別對(duì)各稀釋梯度的陽性樣本檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。
[0021] 表2靈敏度檢測(cè)結(jié)果
根據(jù)表2的結(jié)果顯示，實(shí)施例2的靈敏度為1/8,而實(shí)施例1的靈敏度可以達(dá)到1/32， 這個(gè)結(jié)果說明本發(fā)明的試劑盒具有更高的靈敏度，即使樣本中的丙型肝炎病毒濃度很低也 可以很好的檢測(cè)到，能夠達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防的效果。
[0022] 傳統(tǒng)的丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑盒采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，靈敏度較低，準(zhǔn)確性無法 保證，本發(fā)明利用化學(xué)發(fā)光法的原理，通過包被抗FITC的磁微粒與FITC包被的試劑結(jié)合， 在與被檢測(cè)物進(jìn)行免疫反應(yīng)，在AP標(biāo)記的物質(zhì)免疫反應(yīng)后，構(gòu)成免疫反應(yīng)鏈(如附圖1 )，AP 催化底物發(fā)光的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免顯色，增強(qiáng)了反應(yīng)的靈敏度，同時(shí)利用FITC同時(shí)標(biāo)記 抗原和抗體的方式，可以同時(shí)對(duì)丙型肝炎病毒抗體和核心抗原進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于丙肝檢測(cè)更 加準(zhǔn)確，不會(huì)漏檢，達(dá)到了早發(fā)現(xiàn)的效果，對(duì)丙肝的預(yù)防具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙肝病毒抗原-抗體的試劑盒，其組分如下： 組分I(Rl)磁微粒試劑： 磁微粒與羊抗FITC抗體連接物 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分2 (R2)FITC標(biāo)記試劑： FITC標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% FITC標(biāo)記的NS3蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS4蛋白 1% FITC標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分3 (R3)AP標(biāo)記試劑： AP標(biāo)記的HCV-cAg抗體 1% AP標(biāo)記的NS3蛋白 1% AP標(biāo)記的NS4蛋白 1% AP標(biāo)記的NS5蛋白 1% Tris 12.lg/L BSA 0.5g/L PC-300 0.1% 組分4 (R4)樣本稀釋液： 磷酸氫二鈉 I. 974g/L 磷酸二氫鉀 0? 2245g/L BSA 0.5g/L PC-300 0. 1% 組分5 (R5)發(fā)光底物： 二氧雜環(huán)乙烷（AMPPD) 5mmol/L 組分6 (R6)清洗濃縮液： 磷酸氫二鈉 39. 48g/L 磷酸二氫鉀 4. 49g/L 氯化鈉 18g/L 吐溫-20 0. 5% 所有組分都用去離子水進(jìn)行溶解，配制成溶液狀態(tài)； 陽性對(duì)照： 丙型肝炎病毒核心抗原 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS3) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS4) 1% 丙型肝炎病毒抗體(抗NS5) 1% 用小牛血清溶解 陰性對(duì)照： BSA 4% 用小牛血清溶解。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)丙肝病毒抗原-抗體的試劑盒的檢 測(cè)流程如下： (1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備平底試管，放置在磁分離架上并做好編號(hào)；將R6 (清洗濃縮液） 用20倍去離子水進(jìn)行稀釋，備用； (2) 在試管中加入15y1陽性對(duì)照、陰性對(duì)照或樣本，并加入15yIR4 (樣本稀釋液）； (3) 用連續(xù)移液器在試管中加入30yIR2 (FITC標(biāo)記試劑）； (4) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕震蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (5) 用連續(xù)移液器在試管中加入30ylRl(磁微粒試劑)，加樣時(shí)要保證磁微粒試劑充 分混勾； (6) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37°C溫育5分鐘； (7) 將磁分離架安放在磁分離器上，確保每支試管底接觸磁分離器，靜置2分鐘，然后 弧線傾倒上清液，把倒置的試管連同磁分離器倒扣在吸水紙上拍干； (8) 用連續(xù)移液器在試管中加入300y1清洗液，將磁分離架從磁分離器上取下，置于 振蕩器上1500~2000rpm震蕩20秒，至徹底混勻，重復(fù)第（7)操作1次； (9) 重復(fù)第（8)操作2次； (10) 用連續(xù)移液器在試管中加入30yIR3 (AP標(biāo)記試劑）； (11) 用塑料膜覆蓋磁分離架，置于振蕩器上輕輕振蕩至徹底混勻后，37±1°C溫育5分 鐘； (12) 將磁分離架從磁分離器上取下，每管加入300y1清洗液，置于振蕩器上輕輕震蕩 至徹底混勻，重復(fù)第（7)步操作1次； (13) 重復(fù)第（8)步操作2次； (14) 把試管架從磁分離器上取下，每個(gè)試管加入200y1發(fā)光底物，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè) 發(fā)光強(qiáng)度。
【專利摘要】本發(fā)明利用化學(xué)發(fā)光法的原理，通過包被抗FITC的磁微粒與FITC包被的試劑結(jié)合，在與被檢測(cè)物進(jìn)行免疫反應(yīng)，在AP標(biāo)記的物質(zhì)免疫反應(yīng)后，構(gòu)成免疫反應(yīng)鏈（如圖1），AP催化底物發(fā)光的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免顯色，增強(qiáng)了反應(yīng)的靈敏度，同時(shí)利用FITC同時(shí)標(biāo)記抗原和抗體的方式，可以同時(shí)對(duì)丙型肝炎病毒抗體和核心抗原進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于丙肝檢測(cè)更加準(zhǔn)確，不會(huì)漏檢，達(dá)到了早發(fā)現(xiàn)的效果，對(duì)丙肝的預(yù)防具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】G01N33/576
【公開號(hào)】CN104914244
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510276415
【發(fā)明人】魏海明, 王進(jìn), 譚柏清, 王春艷, 王綺
【申請(qǐng)人】山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日