一種快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的方法，具體涉及一種利用 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC - MS/MS - MRM)快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍 苷的方法，屬于白酒分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國白酒作為世界八大蒸餾酒（白蘭地Brandy、威士忌Whisky、伏特加 Vodka、金 酒Gin、朗姆酒Rum、龍舌蘭酒Tequila、日本清酒Sake、中國白酒Spirit)之一，乙醇含量 比伏特加，威士忌，白蘭地高(通常乙醇體積40%-55%)。中國白酒用谷物生產(chǎn)，如高粱，或小 麥，大麥，玉米，大米與高粱的混合物，通過混合微生物固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后用中國傳統(tǒng)甑桶蒸 餾而成，是一個復(fù)雜開放的體系，這增加了研究白酒中結(jié)合態(tài)氰化物(蜀黍苷)的難度。針對 白酒當(dāng)中蜀黍苷的研究，目前多集中在檢測方法上，而對其合成與調(diào)控機制的研究仍不足。 白酒有多種香型，目前主要有濃香、醬香、清香、米香、鳳香、藥香、豉香、芝麻香、兼香、特型 和老白干11種香型。
[0003] 隨著人們對食品安全的重視度增加，各酒企業(yè)越來越關(guān)注白酒中的安全指標(biāo)，所 以對蜀黍苷定量顯得尤為重要。
[0004] 目前，國內(nèi)關(guān)于白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的研究很少，對蜀黍苷成分的檢測方 法，主要有： 1、液相色譜法（HPLC - DAD)和高效液相色譜法（UPLC - PDAD):高效和超高液相色譜適 合分析難氣化、不易揮發(fā)的物質(zhì)，如酒中的有機酸、氨基酸、生物胺等物質(zhì)，所以液相色譜多 用于檢測白酒中一些安全指標(biāo)物質(zhì)。
[0005] 2、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS):目前白酒分析多使用氣相色譜結(jié)合質(zhì)譜，氣 相色譜分析的物質(zhì)大多是揮發(fā)性組分。氣相色譜主要用于物質(zhì)的分離，通過氣相色譜-質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)，對白酒中的揮發(fā)成分進行定性定量分析，從而對白酒物質(zhì)成分有較全面的了 解。
[0006] 3、高溫酸解法或酶法間接檢測：高溫酸解法是在酸性環(huán)境下加熱使待測樣品水解 之后對水解產(chǎn)物進行檢測進而對目標(biāo)物間接檢測的方法。酶法是在最適條件下對目標(biāo)物進 行水解反應(yīng)之后對水解產(chǎn)物進行檢測的方法，也是間接檢測目標(biāo)物的方法。
[0007] 本發(fā)明所用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS-MRM)只需對白酒釀 酒原料高粱中的蜀黍苷進行簡單的提取預(yù)處理就可快速準(zhǔn)確的進行定量，由于蜀黍苷很可 能是形成蒸餾酒中不利物質(zhì)的重要前體，且本身具有毒性，為了廣大消費者的健康考慮，建 立一套快速定量釀酒原料高粱中蜀黍苷的檢測方法勢在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的方法，具體是利 用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS-MRM)快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍 苷的方法。本發(fā)明使用0.1%甲酸-水及乙腈作為流動相對樣品中的蜀黍苷進行梯度洗脫 分離后串聯(lián)質(zhì)譜檢測，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一種快速檢測白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的方法，其步驟 為： (1) 通過Xevo TQ串聯(lián)四極桿液相質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQ MS，沃特世科技上海有限 公司）檢測蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品來確定其特征離子并建立LC - MS/MS - MRM : a、 用甲醇配制200mg/L的蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液作為最高濃度，用甲醇將其稀釋至 20mg/L作為蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)使用液；取ImL蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)使用液用微孔濾膜過濾處理后放入2mL 樣品瓶待進樣檢測； b、 使用Xevo TQ串聯(lián)四極桿液相質(zhì)譜儀來檢測蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，液相條件：流動相A : 0. 1%甲酸-水；流動相B :乙腈；流速0. 3mL/min ;洗脫梯度：流動相B 4min由5%線性增加 至40%，再Imin由40%線性增加至100%，持續(xù)lmin，再Imin由100%線性減少至5% ;色譜 柱：Waters Acquity C18 column，50mmX2. ImmX 1.7 μπι;進樣量2 μ L ;ESI 離子源；正離子 模式；毛細(xì)管電壓2. 7kV，錐孔電壓20V，碰撞能量12V ;源溫度120°C，去溶劑溫度300°C;去 溶劑氣體流速700L/h，錐孔氣體流速50L /h，碰撞氣體流速0. 15mL/min ; c、 根據(jù)檢測結(jié)果，蜀黍苷母離子為餘々 329,特征子離子為餘々180及餘々132,建立 LC - MS/MS - MRM方法，選擇餘々329-180及餘々329-132作為定性離子對，餘々329-132作 為定量尚子對； (2) LC - MS/MS - MRM方法對白酒釀酒原料高粱中的蜀黍苷定性檢測：取5g磨碎之后的 高粱放置于燒杯中，加入20mL甲醇，超聲波萃取30min后過夜保存，次日取萃取液置于50mL 離心管12000rpm離心30min取上清過濾，加入體積比1:1的超純水，使用旋蒸儀蒸發(fā)去除 20mL甲醇后取ImL待進樣檢測； (3) 制作蜀黍苷定量標(biāo)準(zhǔn)曲線對白酒釀酒原料高粱中的蜀黍苷進行準(zhǔn)確定量： d、 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將20mg/L蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)使用液梯度稀釋成一系列蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)使用液， 以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； e、 白酒釀酒原料高粱預(yù)處理：取5g磨碎后的高粱于燒杯中，加入20mL甲醇，超聲波萃 取30min后過夜，次日將萃取液置于50mL離心管12000rpm離心30min，取上清過濾后加入 體積比1:1的超純水，使用旋蒸儀蒸發(fā)去除20mL甲醇后取ImL待進樣； f、 白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷的定量分析：使用LC - MS/MS - MRM方法檢測樣品，使用 標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明使用0. 1%甲酸-水及乙腈作為流動相對樣品中蜀黍苷 進行梯度洗脫分離后串聯(lián)質(zhì)譜檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終對白酒釀酒原料高粱中蜀黍苷進 行準(zhǔn)確定量。本發(fā)明建立了 一種全新的快速檢測蜀黍苷的方法，操作簡單，檢測靈敏且自動 化程度高，特異性高。
【附圖說明】
[0011] 圖1蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品LC - MS/MS液相圖。
[0012] 圖2蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品LC - MS/MS色譜圖。
[0013] 圖3 LC - MS/MS - MRM法定性檢測釀酒原料高粱中的蜀黍苷。
[0014] 圖4 LC - MS/MS - MRM法定量檢測蜀黍苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1 :不同酒廠釀酒原料高粱中蜀黍苷的定性和定量 (1)通過Xevo TQ串聯(lián)四極桿液相質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQ MS)(沃特世科技上海有限 公司）檢測蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品來確定其特征離子并建立LC - MS/MS - MRM方法： a、用甲醇配制200mg/L蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液作為最高濃度，用甲醇將其稀釋至20mg/ L作為標(biāo)準(zhǔn)使用液。取ImL蜀黍苷標(biāo)準(zhǔn)使用液用微孔濾膜過濾處理后放入2mL樣品瓶待進 樣。
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