一種重組人ii型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種人血清中重組人腫瘤壞死因子受 體-抗體融合蛋白濃度測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor, TNF)，又叫惡病質(zhì)因子 kachectin)， 按其結(jié)構(gòu)分兩型；TNF- α和TNF- β，其中由活化的巨瞻細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生 的能使腫瘤壞死的因子稱為TNF-a ;而把由活化的Τ細(xì)胞和ΝΚ細(xì)胞產(chǎn)生的淋己毒素 (lymphotoxin，LT)稱為TNF-目。目前研究較多的是TNF-a，它是一種由157個氨基酸組 成、相對分子質(zhì)量為17kD的可溶性多膚，成熟型TNF-a的活性形式為Η聚體。
[0003] TNF- α具有廣泛的生物學(xué)活性，對免疫細(xì)胞有活化、促增殖和分化等作用，例如： 參與淋己細(xì)胞的遷移、活化、增殖與分化W及淋己組織的再生，對某些非腫瘤細(xì)胞和大多數(shù) 腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)調(diào)亡的作用，具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的抗瘤作用最強(qiáng)的細(xì) 胞因子，對腫瘤細(xì)胞具有直接的抑制增殖和細(xì)胞壞死作用。TNF-a對其他細(xì)胞（包括必肌 細(xì)胞）的生長分化也有影響，同時還有抗病毒及細(xì)菌，激活T細(xì)胞，促進(jìn)IL-1、比-2、IL-6的 產(chǎn)生及分泌，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IL-2R、EGFR等的表達(dá)等功能，在宿主防御反應(yīng)中起重要 作用。TNF-a具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，在濃度較低時，TNF-a主要作為白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的 自分泌及旁分泌的調(diào)節(jié)物，參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染，促進(jìn)組織修復(fù)及調(diào)節(jié)炎癥 反應(yīng)，引起腫瘤細(xì)胞調(diào)亡等；在高濃度時，過量的TNF-a在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會破 壞機(jī)體的免疫平衡，與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理損傷。TNF-a對眾多的組織器官產(chǎn) 生生物學(xué)效應(yīng)，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中一個重要的多功能成員，是機(jī)體維持內(nèi)部自穩(wěn)、抵御各種 致病因子必不可少的免疫調(diào)節(jié)因子。
[0004] TNF-a參與機(jī)體的多種病理生理過程，包括發(fā)熱、炎癥、創(chuàng)傷愈合、免疫調(diào)節(jié)、病毒 復(fù)制、變態(tài)反應(yīng)、膜島素抵抗和腫瘤殺傷等。當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時，TNF-a對清除受損細(xì) 胞、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡起著重要的作用，是維持機(jī)體內(nèi)部穩(wěn)定、抵御各種致病因子必不 可少的免疫調(diào)節(jié)因子。腫瘤壞死因子-α生產(chǎn)的失調(diào)被認(rèn)為與許多人類疾病有關(guān)，包括阿 茲海默氏癥、癌癥、重性抑郁障礙和腸炎。在某些免疫性疾病如；中重度類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直 性脊柱炎、中重度尋常型銀屑病中，腫瘤壞死因子-α水平升高，引起炎癥反應(yīng)。炎癥得不 到有效治療，疾病就會發(fā)展，最終會造成骨和關(guān)節(jié)的破壞，W及銀屑病皮損遷延不愈。
[0005] TNF- α的生物學(xué)活性主要是通過細(xì)胞膜上的特異受體傳遞信號而實(shí)現(xiàn)的。TNF- α 受體燈NFR)廣泛存在于肝、肺、腎、腸道及肌肉組織中。TNF-a與祀細(xì)胞膜上的TNFR結(jié)合 產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，通過受體后效應(yīng)將信息傳遞到胞核，使mRNA表達(dá)并進(jìn)而合成蛋白質(zhì)。
[0006] TNF-a受體燈NFR)有2種，即相對分子質(zhì)量分別為55000的TNFR I(p55)和75000 的TNFRII (p75)，存在于多種正常及腫瘤細(xì)胞表面。兩類TNFR均為糖蛋白，氨基酸順序分 析顯示兩類受體胞外區(qū)域的氨基酸順序高度相似，但胞內(nèi)區(qū)域則完全不同。TNFR與TNF- α 和TNF-目的結(jié)合具有高度親和力，其KD值均在pmol水平。由于各種細(xì)胞表達(dá)TNFR存在 差異，使得TNF-a對各種細(xì)胞的作用不同，由此表現(xiàn)出其功能及其程度的多樣性。一般來 說，受體數(shù)目越高越容易受到TNF-a的損傷。
[0007] TNF-a等細(xì)胞因子一方面與臟器細(xì)胞膜上的受體結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)；另一方面，細(xì)胞 因子與循環(huán)中的可溶性受體結(jié)合，使循環(huán)中的細(xì)胞因子減少，但在組織中的表達(dá)卻增加， 其在局部中的過度生成導(dǎo)致臟器損害。
[0008] 重組人II型腫瘤壞死因子受體Fc抗體融合蛋白（riiTNFRII ;Fc)是一種采用基因 重組技術(shù)生產(chǎn)的融合蛋白，其一端為TNFRH胞外區(qū)，一端為人IgGl的Fc端。它通過與可 溶性、膜型TNF - a相結(jié)合，特異性阻斷TNF - a與細(xì)胞表面受體的相互作用，阻斷TNF - a 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而治療因 TNF-a失調(diào)所導(dǎo)致的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及銀屑病 等自身免疫疾病。
[0009] 現(xiàn)有測定人血清中重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的方法，一 般為使用測定人II型腫瘤壞死因子受體的商業(yè)化試劑盒對人血清中重組人II型腫瘤壞死 因子受體-抗體融合蛋白，其使用的稀釋液均為化ISA實(shí)驗(yàn)常用稀釋緩沖液，因此所配制出 來的標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品等均不含血清成分，與所測試樣品的基質(zhì)相差甚遠(yuǎn)，并不能保證測 試的準(zhǔn)確性；更糟糕的是，有的樣品本身也需要使用稀釋液進(jìn)行稀釋，如此下來則樣品間基 質(zhì)組分都不一致，所測試結(jié)果可信度也就大打折扣。而在某些方法中，僅僅使用人血清質(zhì)控 樣品及測試樣品的稀釋液，但由于血清中含高濃度的內(nèi)源性II型腫瘤壞死因子受體，使得 實(shí)驗(yàn)本底很高，方法的靈敏度往往達(dá)不到要求。
[0010] 因此，一種準(zhǔn)確測定重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的測定方 法仍是目前所急需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種準(zhǔn)確的測定人血清樣品中重 組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的方法。本發(fā)明的方法可克服方法驗(yàn)證 及樣品檢測過程中做為樣品稀釋液的人血清中內(nèi)源性可溶II型人腫瘤壞死因子受體對待 測重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的背景干擾，提高方法的定量靈敏度。且 本方法所使用標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品及待測樣品均使用同樣的血清進(jìn)行稀釋，保證基質(zhì)組分 一致。具體地，發(fā)明公開了 ：
[0012] 1、一種重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度的測定方法，其特征在 于，待測樣品為人血清，待測樣品的稀釋液為已去除內(nèi)源性TNFRII的正常人血清。
[001引 2、根據(jù)上述1所述的方法，其特征在于，所述去除內(nèi)源性TNFRII的正常人血清是 通過利用鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠及生物標(biāo)記的抗TNFRII單克隆抗體純化正常人血清獲 得。
[0014] 3、根據(jù)上述2所述方法，其特征在于，包括如下步驟：
[001引 （1)使用生物素標(biāo)記抗TNFRII單克隆抗體；
[0016] (2)使用鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠捕獲步驟（1)所得的生物素標(biāo)記的抗TNFRH單克 隆抗體；
[0017] (3)使用步驟（2)所得的捕獲生物素標(biāo)記抗TNFRn單克隆抗體的鏈霉親和素偶聯(lián) 的磁珠純化正常人血清，獲得去除內(nèi)源性TNFRII的正常人血清；
[0018] (4)使用步驟（3)獲得的去除內(nèi)源性TNFRn的正常人血清作為稀釋液稀釋待測樣 品，測定待測樣品中重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白濃度。
[0019] 4、根據(jù)上述3所述方法，其特征在于，步驟（4)所述重組人II型腫瘤壞死因子受 體-抗體融合蛋白濃度是通過具有高度特異性的雙特異性單克隆抗體夾必ELISA方法測 定。
[0020] 5、根據(jù)上述4所述方法，其特征在于，所述方法的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控樣品及待測樣品的 稀釋液均是權(quán)利要求3步驟（3)所獲得的去除內(nèi)源性TNFRII的正常人血清。
[0021] 6、根據(jù)上述4所述的方法，其特征在于，所述重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗 體融合蛋白濃度測定還使用具備高信噪比的生物素-親和素信號系統(tǒng)進(jìn)行測定。
[0022] 7、根據(jù)上述3所述方法，其特征在于，所述抗TNFRII單克隆抗體是MAB726抗體。
[0023] 8、根據(jù)上述7所述方法，其特征在于，所述MAB726抗體（重量）；鏈霉親和素偶聯(lián) 的磁珠（體積）比為Img ;4ml。
[0024] 9、一種驗(yàn)證上述1-8任一所述方法的驗(yàn)證方法，其特征在于，所述驗(yàn)證包括