底物緩沖液配制
[0053] 稱取11. 07g -水巧樣酸，18. 80g無水磯酸氨二鋼，加入至約800mL去離子水中，攬 拌W充分溶解。調(diào)整抑至5.4 + 0.1，用去離子水定容至比，填寫瓶上試劑標(biāo)簽。4±2°C保 存，有效期3個(gè)月并不得超過所用任一試劑有效期。
[0054] (7) TMB儲液配制
[00巧]稱取200mg TMB (3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）粉末，加入至一合適大小玻璃瓶并加 入lOOmL無水己醇，W錫巧紙包裹，填寫瓶上試劑標(biāo)簽，置于4±2°C冰箱中溶解過夜，配制 過程盡可能避光。4±2Γ保存，有效期1年并不得超過所用任一試劑有效期。
[0056] (8)3 %過氧化氨配制
[0057] 吸取100 μ L 30 %過氧化氨，加入至900 μ L去離子水中，攬拌混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。 [005引 （9)終止液（1Μ硫酸）制備
[0059] 量取850mL去離子水，加入至合適大小的玻璃燒杯中。沿著瓶壁緩慢加入50mL 98 %濃硫酸，邊加邊攬拌W散熱。將配制好的終止液轉(zhuǎn)移至潔凈溶液瓶中，室溫保存，有效 期一年并不得超過所用任一試劑有效期。
[0060] 實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控樣品儲液制備
[0061] (1)標(biāo)準(zhǔn)品儲液制備
[0062] 用純化人血清將參考品稀釋成儲液A(1000000ng/mL)，再用純化人血清依次進(jìn) 行 10 倍比稀釋，一共 6 個(gè)儲液濃度 A (lOOOOOOng/mL)、B (lOOOOOng/mL)、C (lOOOOng/mL)、 D(l〇〇〇ng/mL)、E(100ng/mL)和F(l〇ng/mL)。使用純化人血清及各個(gè)儲液分別配制50X 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)樣品儲液，一共11個(gè)濃度及一個(gè)空白對照，濃度分別為SOI儲液巧OOng/ 血，）、S02 儲液（400ng/mL)、S03 儲液（250ng/mL)、S04 儲液（128ng/mL)、S05 儲液化4ng/ 血）、S06 儲液（3化g/mL)、S07 儲液（16ng/mL)、S08 儲液（8ng/mL)、S09 儲液（4ng/血）、S10 儲液（2ng/mL)、Sll儲液（Ing/mL)和NSB儲液（Ong/mL)。具體配制方案見表1。臨用前 將各標(biāo)準(zhǔn)品儲液用稀釋液進(jìn)行1:50預(yù)處理（如取10 μ L標(biāo)準(zhǔn)品儲液，加入490 μ L稀釋液 中），標(biāo)準(zhǔn)曲線各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最終濃度為SOI (lOOOOpg/mL)、S02(8000pg/mL)、S03(5000pg/ 血）、S04 (2560ng/mL)、S05 (1280pg/mL)、S06 (640pg/mL)、S07 (320pg/mL)、SOS (160pg/mL)、 S09 (80pg/mL)、SIO (40pg/mL)、Sll (20pg/mL)和 NSB (Opg/mL)。
[0063] 表1.柄準(zhǔn)品儲液制備
[0064]
[0066] 似質(zhì)控樣品儲液制備
[0067] 用純化人血清將參考品稀釋成儲液1 (lOOOOOOng/mL)，再用純化人血清依次進(jìn) 行 10 倍比稀釋，一共 6 個(gè)儲液濃度 1 (lOOOOOOng/mL)、2(l〇〇〇〇〇ng/mL)、3(l〇〇〇〇ng/mL)、 4(1000ng/mL)、5(10化g/mL)和6(10ng/mL)。使用純化人血清及各個(gè)儲液分別配制質(zhì)控樣 品儲液，一共3個(gè)濃度，濃度分別為冊C儲液（375ng/mL)、MQC儲液（4化g/mL)和LQC儲 液化ng/mL)。具體配制方案見表2。臨用時(shí)用稀釋液進(jìn)行1 ;50預(yù)處理（如取10 μ L質(zhì) 控品儲液，加入490 μ L稀釋液中），質(zhì)控品終濃度為冊C(7500pg/mL)、MQC(8(K)pg/mL)和 LQC(120pg/mL)〇
[006引表2.質(zhì)控樣品儲液制備
[0069]
[0070] 實(shí)施例祀LISA方法測定人血清中重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白 濃度
[0071] 用包被緩沖液將10417-R006兔抗人p75單抗稀釋至終濃度0. 5 μ g/mL的包被抗 體溶液，配制后混勻。向高吸附96孔板每孔加入100 μ L包被抗體溶液，用封板膜封住96 孔板，放置4°C冰箱中包被過夜。
[0072] 甩掉板中包被抗體溶液，拍去殘留液體。每孔加入300 μ L封閉緩沖液置于25°C培 養(yǎng)箱中賠育2小時(shí)。在聚丙帰微孔管中向490 μ L/管的稀釋緩沖液分別加入10 μ L的標(biāo)準(zhǔn) 品、質(zhì)控樣品或樣品儲液（1 ;50)，在放置于25°C培養(yǎng)箱中的微孔板震蕩器上W 900轉(zhuǎn)速預(yù) 處理至少半小時(shí)。
[0073] 使用PBST洗液洗板。每孔加入100 μ L預(yù)處理后的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控樣品或樣品溶液， 用封板膜封住96孔板，在放置于25Γ培養(yǎng)箱中的微孔板震蕩器上W 500轉(zhuǎn)速培養(yǎng)90分鐘。 用稀釋緩沖液將生物素標(biāo)記鼠抗ρ75單抗Τ1815稀釋至10化g/mL的檢測抗體溶液。
[0074] 使用PBST洗液洗板。每孔加入100 μ L檢測抗體溶液，用封板膜封住96孔板，在 放置于25°C培養(yǎng)箱中的微孔板震蕩器上W 500轉(zhuǎn)速培養(yǎng)60分鐘。用稀釋緩沖液將SA-HRP 稀釋至50ng/mL的SA-HRP溶液。
[007引使用PBST洗液洗板。每孔加入100 μ L SA-HRP溶液，用封板膜封住96孔板，在放 置于25°C培養(yǎng)箱中的微孔板震蕩器上W 500轉(zhuǎn)速培養(yǎng)30分鐘。從保存于4°C冰箱中的底 物緩沖液中取出所需量，于25Γ培養(yǎng)箱中平衡溫度至少30分鐘。臨用前按照體積比TMB底 物；底物緩沖液；3%雙氧水=50 ;949 ;1配制底物溶液，盡可能避光。
[0076] 使用PBST洗液洗板。每孔加入100 μ L ΤΜΒ底物溶液，用封板膜封住96孔板，25°C 反應(yīng)30分鐘。每孔加入100 μ L終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取450-650nm吸光值。
[0077] 通過SoftMax Pro計(jì)算機(jī)軟件，W各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度為X軸，OD值為y軸，使用四參數(shù) 擬合回歸模型繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重因子1/Y2。通過質(zhì)控樣品/樣品的0D值與同板上標(biāo)準(zhǔn)曲 線的0D值比對計(jì)算出相應(yīng)濃度.標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程如下
[0078] Υ= (A-D)/(1+(X/C) " B)+D
[007引 X ;標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)理論濃度
[0080] Y ;標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)0D值
[0081] A ;標(biāo)準(zhǔn)曲線下漸近線
[008引 B;標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率
[0083] C ;半數(shù)有效濃度
[0084] D;標(biāo)準(zhǔn)曲線上漸近線。
[00財(cái) 實(shí)施例6方法驗(yàn)證
[0086] W下方法驗(yàn)證實(shí)施案例，如無特殊說明，均按照實(shí)施例5方法進(jìn)行
[0087] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證
[008引每次血藥濃度測試均需要平行測試一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線本身能否符合要 求首先得經(jīng)過驗(yàn)證。由3位實(shí)驗(yàn)者在5天內(nèi)進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，每一次實(shí)驗(yàn)由每位實(shí)驗(yàn)者使用 100%純化人血清做為稀釋液單獨(dú)配制一份標(biāo)準(zhǔn)曲線儲液，臨用前將各標(biāo)準(zhǔn)品儲液用稀釋 液進(jìn)行1:50預(yù)處理，其中SOI~S10數(shù)據(jù)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證。標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證結(jié)果見表3。
[0089] 表3.標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證結(jié)果
[0090]
[0091] 似準(zhǔn)確性與精密度
[0092] 濃度測定實(shí)驗(yàn)需要保證一定的定量準(zhǔn)確性與重復(fù)測試的精密度，W此保證所測定 樣品數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，因此準(zhǔn)確性與精密度需要進(jìn)行驗(yàn)證。由3位實(shí)驗(yàn)者在5天內(nèi)進(jìn)行6次 實(shí)驗(yàn)，每一次實(shí)驗(yàn)由每位實(shí)驗(yàn)者使用100%純化人血清做為稀釋液單獨(dú)配制一份標(biāo)準(zhǔn)曲線 儲液。驗(yàn)證樣品儲液由一位實(shí)驗(yàn)者一次性配制并分裝，濃度分別為化0Q儲液巧OOng/mL)、 冊c 儲液（375ng/mL)、MQC 儲液（40ng/mL)、LQC 儲液化ng/mL)和化OQ 儲液（2ng/mL)，所有 的驗(yàn)證樣品在-8(TC保存