一種適用于提取香蕉不同組織的基因組dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA分子標記技術(shù)已廣泛用于植物種質(zhì)資源研宄。通過分子標記輔助育種可以大 大縮短育種周期，不受發(fā)育時期、組織器官和環(huán)境條件等因素影響。高效、快速制備高質(zhì)量 的基因組DNA，并保證DNA的純度和完整性，是進行分子標記和其他分子生物學(xué)試驗的基 礎(chǔ)。
[0003] 從植物組織中提取基因組DNA的常用方法有CTAB (十六烷基三乙基溴化銨）法和 SDS(十二烷基磺酸鈉）法，以及基于這兩種方法的改良法。這些方法適用于香蕉幼嫩組織 的基因組DNA提取，提取的DNA純度能夠滿足一般分子生物學(xué)的需要，但對于富含多糖、多 酚的香蕉果實而言就需要通過分步離心，或加入醋酸鉀和氯仿/異戊醇多次抽提，不僅提 取效果不能保證，而且操作步驟復(fù)雜，耗時長，易交叉污染?，F(xiàn)有的實驗操作中采用一種組 織對應(yīng)一種方法的方式提取植物不同組織的基因組DNA，由于每種方法要配置的藥品不同、 操作步驟各異，因此會增多實驗步驟，加大工作量。
[0004] 鑒于上述情況，期望獲得一種從香蕉不同組織器官中均能快速提取高質(zhì)量的基因 組DNA的方法，即，僅應(yīng)用一種方法就可提取香蕉不同組織器官中的基因組DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在解決上述問題。
[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法。
[0007] 本發(fā)明的適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA方法包括如下步驟：步驟一：取 香蕉組織樣品，加入液氮后研磨成粉末，轉(zhuǎn)至離心管中；步驟二：在所述步驟一的所述香蕉 組織樣品中加入提取緩沖液、10% SDS與氯化芐，充分混勻后水?。徊襟E三：在經(jīng)所述步驟 二得到的混合液中加入乙酸鈉冰浴，然后離心分離；步驟四：取經(jīng)所述步驟三所得的上清 至一干凈離心管，加入預(yù)冷的異丙醇，混勻后離心分離，棄上清液；步驟五：取經(jīng)所述步驟 四得到的沉淀用75%的乙醇洗滌，室溫揮發(fā)乙醇，然后加入TE buffer或無菌水，再用適量 的RNase A消化，取出后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 進一步的，所述步驟一中所述香蕉組織樣品的用量為0. 5g ;所述步驟二中所述提 取緩沖液的用量為ImU所述10% SDS的用量為150 yL、所述氯化芐的用量為200 yL~ 800 μ L ;所述步驟三中加入所述乙酸鈉的含量為450 μ L ;所述步驟四中的所述異丙醇的用 量為0· lmL。
[0009] 進一步的，所述氯化芐為600 μ L。
[0010] 進一步的，所述提取緩沖液包括pH 9.0的IOOmmol · Llris-HCl、pH 8.0的 40mmo1 · L <EDTA。
[0011] 進一步的，所述步驟二中水浴溫度為65°C，水浴時間為45min。
[0012] 進一步的，所述步驟三中所述乙酸鈉冰浴所述混合液的時間為15min，且設(shè)定的離 心參數(shù)為13000 Xg離心8min。
[0013] 進一步的，所述步驟四中設(shè)定的離心參數(shù)為13500Xg離心10min。
[0014] 進一步的，所述步驟五中所述75%的乙醇洗滌所述沉淀的次數(shù)為兩次。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA方法不 受取材限制，從香蕉不同組織器官中均能快速提取高質(zhì)量的基因組DNA，而且從單位香蕉組 織樣品中提取的基因組DNA的純度高并且收率高。
【附圖說明】
[0016] 圖1-1示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的CTAB常規(guī)法和CTAB改良法1提取香蕉各組織基因組 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0017] 圖1-2示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的CTAB改良法3和CTAB改良法2提取香蕉各組織基因 組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0018] 圖1-3示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的SDS法和SDS結(jié)合蛋白酶K法提取香蕉各組織基因組 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0019] 圖1-4示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的改良尿素法和根據(jù)本發(fā)明的氯化芐法提取香蕉各組 織基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0020] 圖2示出根據(jù)本發(fā)明的氯化芐法中不同濃度氯化芐提取香蕉各組織基因組DNA的 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0021] 圖3示出根據(jù)本發(fā)明的氯化芐法DNA的ITS擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0022] 下文將結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實施例中描述的技 術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到更好的 技術(shù)效果。
[0023] 香蕉基因組DNA提取方法的比較實驗
[0024] 在香蕉基因組DNA提取方法比較實驗中，香蕉的葉、假莖、根和果實樣品均采自國 內(nèi)香蕉主栽品種'巴西蕉'（Musa Cavendish AAA)。此外，果實催熟后分別對果皮和果肉部 位進行采樣。所有樣品采集后迅速用95%的酒精清洗，分別置于-80°C超低溫冰箱中保存 備用。
[0025] 取0. 5g上述各樣品，加入適量液氮后研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)至2mL離心管中，然后分 別按下述方法提取基因組DNA。
[0026] (1)氯化芐法（即本發(fā)明的方法）
[0027] 步驟如下：
[0028] 實施例1 :
[0029]①加入 ImL 提取緩沖液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化芐200 μ L，充分混勻后65°C水浴45min，期間每隔IOmin 搖勻一次；
[0030] ②加入450 μ L乙酸鈉冰浴15min，在設(shè)定的離心參數(shù)為13000 Xg的條件下離心 8min ；
[0031] ③取上清至一新離心管，加入0. lmL_20°C預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勾后在設(shè)定 的離心參數(shù)為13500 Xg的條件下離心10min，棄上清液；
[0032] ④取沉淀用75%的乙醇洗滌2次，室溫揮發(fā)乙醇，用TE buffer或無菌水溶解DNA， 再用適量的RNase A消化（37°C水浴Ih)，取出后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 實施例2 :
[0034] ①加入 ImL 提取緩沖液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化芐600 μ L，充分混勻后65°C水浴45min，期間每隔15min 搖勾一次；
[0035] ②加入450 yL乙酸鈉冰浴15min，在設(shè)定的離心參數(shù)為13000 Xg的條件下離心 8min ；
[0036] ③取上清至一新離心管，加入0. lmL_20°C預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后在設(shè)定 的離心參數(shù)為13500 Xg的條件下離心10min，棄上清液；
[0037] ④取沉淀用75%的乙醇洗滌2次，室溫揮發(fā)乙醇，用TE buffer或無菌水溶解DNA， 再用適量的RNase A消化（37°C水浴2h)，取出后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0038] 實施例3 :
[0039] ①加入 ImL 提取緩沖液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化芐800 μ L，充分混勻后65°C水浴45min，期間每隔 10_15min 搖勾一次；
[0040] ②加入450 μ L乙酸鈉冰浴15min，在設(shè)定的離心參數(shù)為13000 Xg的條件下離心 8min ；
[0041] ③取上清至一新離心管，加入0. lmL-20°C預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒混勻后在設(shè)定 的離心參數(shù)為13500 Xg的條件下離心10min，棄上清液；
[0042] ④取沉淀用75%的乙醇洗滌2次，室溫揮發(fā)乙醇，用TE buffer或無菌水溶解DNA， 再用適量的RNase A消化（37°C水浴l_2h)，取出后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 實施例4 :
[0044] ①加入 ImL 提取緩沖液（IOOmmol · L-I Tris-HCl pH 9. 0、40mmol · L-I EDTA pH 8. 0)，以及150 μ L 10% SDS和氯化芐400 μ L，充分混勻后65°C水浴45min，期間每隔