0 μ L氯化芐的氯化芐法；C4 :800 μ L氯化 芐的氯化芐法。如圖2中所示，在C4下，1泳道（果肉）中條帶明顯與其它泳道中的條帶 跑得慢，而且條帶模糊，這可能是該果肉基因組DNA中含有較多的蛋白質(zhì)以及酚類；在CU C2與C3下，條帶狀況基本相似，但Cl與C2下，泳道2中條帶非常淡，而C3中，各泳道的帶 比較清晰、整齊。綜上所示，C3(600 yL氯化芐的氯化芐法）最適于提取香蕉各組織中的基 因組DNA。
[0084] (2)吸光度檢測
[0085] 利用核酸蛋白測定儀（Eppendorf BioPhotometer Plus)檢測按上述各種方法提 取的香蕉基因組DNA樣品的質(zhì)量濃度（單位樣品中提取出的基因組DNA的質(zhì)量，單位：μ g/ mL)以及在波長260nm、280nm處的吸收值A260和A280,計算A260/A280用以判斷DNA的純 度。表1示出不同方法提取香蕉各組織DNA的質(zhì)量濃度（μ g/mL)。表2示出不同DNA提取 方法提取香蕉各組織DNA的A260/A280值。表3示出氯化芐法中添加不同濃度氯化芐提取 香蕉各組織DNA的質(zhì)量濃度（μ g/mL)、A260/A280值。
[0086] 純DNA的A260/A280比值為1 · 8，若A260/A280比值在1 · 7~1 · 9之間，則表明DNA 的純度較高；若比值在1. 5及以下則表示DNA溶液中含50%以上的蛋白質(zhì)，即，DNA受到蛋 白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染。
[0087] 表1中明顯可見氯化芐法^OOyL)無論在香蕉的葉、假莖與根中，還是在果皮以 及果肉中提取出的基因組DNA的質(zhì)量濃度均高于其它方法中提取的基因組DNA。
[0088] 如表2中所示，僅CTAB改良法2與氯化芐法（600 μ L)能從香蕉各組織（葉、假莖、 根、果皮以及果肉）中提取出基因組DNA ;并且僅氯化芐法（600 μ L)的Α260/Α280比值均 在1. 7~1. 9之間，如上所述，上述方法中僅氯化芐法（600 μ L)能從香蕉各組織中提取出 純度高的基因組DNA。
[0089] 如表3中所示，600 μ L氯化芐的氯化芐法在香蕉葉、假莖、根中提取的基因組DNA 的質(zhì)量濃度均高于其它濃度的氯化芐法，而且Α260/Α280比值均在1. 7~1. 9之間；雖然 600 μ L氯化芐的氯化芐法在香蕉果肉中提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度低于800 μ L氯化芐 的氯化芐法，但是600 μ L氯化芐的氯化芐法的Α260/Α280比值高于800 μ L氯化芐的氯化 芐法的Α260/Α280比值，并且小于1. 8,另外，600 μ L氯化芐的氯化芐法在香蕉果皮、果肉中 提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度均明顯高于200 μ L、400 μ L的氯化芐的氯化芐法中提取的基 因組DNA的質(zhì)量濃度。
[0090] 綜上所述，在綜合考慮基因組DNA質(zhì)量濃度與純度的情況下，600 μ L氯化芐的氯 化芐法是提取香蕉不同組織的基因組DNA的最優(yōu)方法。
[0091] 表1不同方法提取香蕉各組織DNA的質(zhì)量濃度對比
[0092]
[0093] 表2不同DNA提取方法提取香蕉各組織DNA的A260/A280值對比
[0094]
[0095] 表3氯化芐法中添加不同濃度氯化芐提取香蕉各組織DNA的質(zhì)量濃度對比
[0096]
[0097] (3) PCR擴增檢測
[0098] 分別從香蕉品種：Calcutta 4 ;巴西蕉（香牙蕉類）；Mbwazirume (東非高原香 蕉）；Mbi Egomel(Plantain);過山香；東莞大蕉（大蕉類）；廣粉1號（粉蕉類）；貢蕉中 取樣，然后將所有樣品迅速用95%的酒精清洗，分別置于-80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0099] 取0. 5g上述各樣品，加入適量液氮后研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)至2mL離心管中，然后分 別按氯化芐法（添加600 μ L氯化芐）提取基因組DNA。
[0100] 以上述基因組DNA為模板，采用香蕉內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4/ITSL進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后EB染色，在紫外光下觀察、拍照。
[0101] 在圖3中，M :Maker(2000)的泳道；附圖標記1、2、3、4、5、6、7以及8分別 表示香蕉品種Calcutta 4、巴西蕉（香牙蕉類）、Mbwazirume(東非高原香蕉）、Mbi Egomel (Plantain)、過山香、東莞大蕉（大蕉類）、廣粉1號（粉蕉類）以及貢蕉的基因組 DNA的PCR產(chǎn)物的泳道。如圖3中所示，電泳條帶均清晰可見，為單一的700bp左右大小的 帶，符合香蕉種質(zhì)資源ITS特有片段，由此可見，由氯化芐法（添加600 μ L氯化芐）提取的 DNA符合PCR操作的需求。
[0102] 綜上所述，采用氯化芐法可簡便、快速地提取香蕉不同組織的基因組DNA，而且所 提取的基因組DNA完整性好、純度高，適于PCR操作的需求；與提取基因組DNA的其它方法 相比，就提取香蕉果皮、果肉的基因組DNA而言，600 yL氯化芐的氯化芐法效果尤其凸顯。
[0103] 本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的具體實施例，但是本領域的技術人員應當理解，在 不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實施例進行改變。上述實施例只是示例性的，不 應以本文的實施例作為本發(fā)明權利范圍的限定。
【主權項】
1. 一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一：取香蕉組織樣品，加入液氮后研磨成粉末，轉(zhuǎn)至離心管中； 步驟二：在所述步驟一中所得的所述香蕉組織樣品中加入提取緩沖液、10%SDS與氯 化芐，充分混勻后水?。? 步驟三：在經(jīng)所述步驟二得到的混合液中加入乙酸鈉冰浴后離心分離； 步驟四：取經(jīng)所述步驟三所得的上清液至離心管中，加入預冷的異丙醇，混勻后離心分 離，棄上清液； 步驟五：取經(jīng)所述步驟四得到的沉淀用75%的乙醇洗滌，室溫揮發(fā)乙醇，然后加入TEbuffer或無菌水，再用RNaseA消化后于-20°C保存?zhèn)溆谩?.如權利要求1所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法，其特征在 于，所述步驟一中所述香蕉組織樣品的用量為〇.5g ;所述步驟二中所述提取緩沖液的用量 為ImU所述10%SDS的用量為150yL、所述氯化芐的用量為200yL~800yL;所述步驟 三中加入所述乙酸鈉的含量為450yL;所述步驟四中所述異丙醇的用量為0.lmL。3. 如權利要求2所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法，其特征在 于，所述氯化芐的用量為600yL。4. 如權利要求2所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法，其特征在 于，所述提取緩沖液包括pH9. 0 的IOOmmol? !/1Tris-HCl與pH8. 0 的 40mmol?LlDTA。5. 如權利要求2至4任一項所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方 法，其特征在于，所述步驟二中水浴溫度為65 °C，水浴時間為45min。6. 如權利要求2至4任一項所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方 法，其特征在于，所述步驟三中所述乙酸鈉冰浴所述混合液的時間為15min，且設定的離心 參數(shù)為13000Xg離心8min。7. 如權利要求2至4任一項所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方 法，其特征在于，所述步驟四中設定的離心參數(shù)為13500Xg離心lOmin。8. 如權利要求2至4任一項所述的一種適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方 法，其特征在于，所述步驟五中所述75%的乙醇洗滌所述沉淀的次數(shù)為兩次。
【專利摘要】本發(fā)明的適用于提取香蕉不同組織的基因組DNA的方法包括：取香蕉組織樣品，加入液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)至離心管中；然后，加入提取緩沖液、10％SDS與氯化芐，充分混勻后水??；接著，加入乙酸鈉冰浴，然后離心；取經(jīng)上一步驟所得的上清至一干凈離心管，加入預冷的異丙醇，混勻后離心，棄上清液；取經(jīng)上一步驟得到的沉淀用75％的乙醇洗滌，室溫揮發(fā)乙醇，然后加入TE buffer，再用適量的RNase A消化，取出后于-20℃保存?zhèn)溆?。上述方法不受取材限制，從香蕉不同組織器官中均能快速提取高質(zhì)量的基因組DNA，而且從單位香蕉組織樣品中提取的基因組DNA的純度高并且量大。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN104894104
【申請?zhí)枴緾N201510202596
【發(fā)明人】盛鷗, 鄧貴明, 魏岳榮, 鄺瑞彬, 李春雨, 易干軍
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年4月23日